【最新成果】丁苯酞减轻脑出血后炎症反应和水肿-凯发app平台

发表于：2020年07月03日 发表人：石药集团

2020年6月来自中南大学湘雅第二医院神经内科胡治平教授研究团队的最新成果《l-3-n-butylphthalide attenuates inflammation response and brain edema in rat intracerebral hemorrhage model 》在《aging》杂志发表（if=4.831）。

本研究旨在探讨nbp对大鼠ich模型的治疗作用，并探讨其潜在的分子机制。研究结果证明：nbp抑制tnf-α和mmp-9的表达，减少炎症反应，改善血脑屏障通透性，减轻ich诱导的损伤区域细胞毒性和血管性水肿。本研究结果为脑出血的治疗和nbp的临床应用提供了有力证据。


01  研究背景

脑出血是中风最严重的亚型，在中低收入国家中发病率高，死亡率高。尽管人们对ich（脑出血）的认识不断发展，但死亡率并未随时间推移降低。目前，ich的30天死亡率仍然高达35–50％，其中约50％的死亡率发生在发病前两天内。ich后的脑损伤大致可分为原发性和继发性脑损伤。原发性脑损伤主要是由血肿破坏和压迫脑组织引起的。继发性脑损伤主要是由于炎症反应，加剧血肿附近的脑水肿。ich后脑水肿可导致不良结果，例如严重的神经功能缺损，脑疝甚至死亡。关于ich治疗的临床前报道很多，其中大多数集中在原发性损伤的治疗上，例如颅内压降低，血压控制和康复，并且在临床上应用。但不幸的是，没有一种临床治疗方法能够减轻因炎症反应引起的继发性脑损伤来提高ich后的生存率。nbp已有研究表明可能通过多种机制对缺血性中风有治疗作用，包括减少缺血性中风的炎症反应，减轻小胶质细胞活化，降低细胞因子水平如肿瘤坏死因子-α（tnf-α），减少血脑屏障（bbb）损伤和脑水肿，并促进髓鞘再生。本研究主要探讨nbp对大鼠ich模型的治疗作用。


02 研究方法


本实验将45只成年雄性sprague-dawley大鼠（10周龄，280-320g）随机分为三组：
（1）假手术组（n=15），无ich模型；
（2）ich模型大鼠采用生理盐水处理的对照组（n=15）；
（3）ich模型采用nbp处理的治疗组（n=15）。
通过评估手术后48小时的神经功能，血肿周围脑水含量，血脑屏障通透性以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，tnf-α)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，mmp-9)的表达来评价nbp的治疗效果。在ich后4h和48h分别进行磁共振成像t2加权图像测量脑损伤区域体积。



03 研究结果


1、nbp改善脑出血后的神经功能缺损情况

脑出血会使神经功能受损，本研究采用改良garcia(mgarcia)神经评分检测nbp对脑出血后神经功能缺损的治疗作用。该评分神经损伤越严重，mgarcia评分越低。术后48h，假手术组mgarcia评分正常。vehicle组和nbp组大鼠脑出血术后出现左侧偏瘫现象。虽然vehicle组/nbp治疗组的mgarcia评分明显低于假手术组(p<0.05)，意味这两组的大鼠在ich术后均出现了明显的神经功能缺损，但nbp治疗组的大鼠获得的mgarcia评分明显高于对照组(p<0.05；图1a)。这些结果表明，nbp治疗可以有效改善ich损伤后的神经功能缺损。

2、nbp减轻脑出血后的脑水肿形成

脑水肿是脑出血后继发性脑损伤的表现之一。本研究通过观察生理盐水或nbp治疗后脑水肿的程度来探讨nbp对脑出血后脑水肿的影响。vehicle组脑含水量明显高于假手术组（p<0.05）。此外，nbp组的脑含水量明显低于vehicle组（p<0.05；图1b）。he染色也观察到类似的结果。在vehicle组中观察到明显的组织水肿，但nbp治疗显著改善了脑水肿（图1c）。结果表明，nbp可减轻脑出血后水肿。

3、nbp降低脑出血后血脑屏障通透性

采用改良的eb染色法观察血脑屏障的血管通透性。vehicle组eb渗出量明显高于假手术组（p<0.05）。此外，nbp组的eb渗出明显低于vehicle组（p<0.05；图1d）。结果表明，nbp能显著降低大鼠ich模型中eb的外渗量，降低bbb的通透性。

图1.nbp的治疗作用

（a） nbp改善了脑出血后的神经功能；

（b）nbp减轻了脑出血后水肿；

（c）脑组织he染色（标度：200μm）；

（d）nbp降低了脑出血后bbb的通透性。

在脑出血模型建立后48小时记录数据，以平均值±标准差（每组n=6）表示。*，p<0.05。nbp：丁苯酞；bbb：血脑屏障；ich：脑出血。


4、nbp降低脑出血后血肿扩大

采用磁共振成像（magnetic resonance imaging,mri）观察脑出血模型大鼠，以直观地显示nbp对脑出血模型大鼠血肿扩大的影响。vehicle组和nbp治疗组的sd大鼠在ich模型建立后均有清晰可辨的血肿形成，如图2典型的t2加权图像所示。vehicle组和nbp治疗组脑血肿在t2加权成像的信号强度在4h后呈低强度，在48h转为高强度（图2a）。在ich造模后4h对大鼠头部进行mri扫描，nbp治疗组的血肿体积与对照组大致相同，无统计学意义上的差异（p>0.05）。而术后48小时再次对大鼠头部行mri扫描，发现在术后4h至48h期间，对照组的血肿体积明显增大，而nbp治疗组的血肿体积无明显变化。即nbp治疗组的血肿再扩大体积明显小于对照组（15.22±3.31mm3 vs 2.91±0.40mm3，p＜0.05；图 2b），说明nbp能有效抑制ich后血肿再扩大体积

5、nbp抑制促炎因子tnf-α和mmp-9的表达

以往研究表明，炎症可能是ich后继发性脑损伤和脑水肿形成的关键机制之一。为了探讨nbp对脑出血大鼠模型的抗炎作用，我们首先检测了血肿周围脑组织中促炎因子tnf-α的表达水平。western-blotting结果显示脑出血损伤导致肿瘤坏死因子-α表达增加。同时，nbp治疗能显著降低tnf-α的表达。我们还检测了血肿周围皮质组织中mmp-9的表达。与假手术组相比，vehicle组tnf-α与mmp-9表达均上调。与vehicle相比，nbp组mmp-9的表达水平下降（图2c）。用免疫组化染色观察tnf-α和mmp-9表达与western-blotting有相似结果（图2d）。提示nbp具有抗炎作用，可预防脑出血后继发性损伤。

图2.nbp对脑出血后损伤面积变化的影响

（a）vehicle组和nbp组代表性的t2-wi图像；

（b）定量不同时间点（ich后4小时和48小时）的血肿体积；

（c）血肿周围脑组织中tnf-α和mmp-9的表达；

（d）免疫组化染色法测定血肿周围脑组织中tnf-α和mmp-9的表达（标度：200μm）。

δ表示扩大的损伤面积体积，用4小时时测量的体积减去48小时时测量的体积。数据以平均值±标准差表示（每组n=3）。n.s，无显著性差异；*，p<0.05。ich：脑出血；nbp：丁苯酞；mmp-9：基质金属蛋白酶-9；tnf-α：肿瘤坏死因子α。


6、nbp抑制氧化应激和dna损伤

氧化应激与炎症密切相关，因此本文还研究了nbp对超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）、活性氧（ros）水平的影响。在vehicle组中，sod（图3a）降低，但mda（图3b）和ros（图3c）显著增加。但nbp处理显著逆转了这种趋势，抑制了氧化应激。同时测定nbp处理后dna损伤标志物γ-h2ax。我们发现nbp显著抑制了γ-h2ax的水平，表明nbp可以抑制dna损伤（图3d）。

图3.nbp抑制氧化应激和dna损伤

（a） 血清sod水平；血清mda水平；脑组织ros水平（300μm）；血肿周围脑组织γ-h2ax表达。数据表示为平均值±标准差（n=3，每组）。*，p<0.05。ros：活性氧；sod：超氧化物歧化酶；mda：丙二醛。        


图4.nbp能减轻脑出血时的炎症和脑水肿

nbp治疗能显著抑制炎症反应，减轻脑出血引起的水肿，保护bbb不受破坏。

bbb：血脑屏障；cns：中枢神经系统；mmp-9：基质金属蛋白酶-9；nbp：丁苯酞；ros：活性氧；tnf-α：肿瘤坏死因子α。




综上所述，本研究结果表明nbp能抑制tnf-α和mmp-9的表达，从而减轻炎症反应，降低bbb通透性、减轻ich诱导的损伤区及细胞毒性和血管性水肿。这一发现为脑出血的治疗和nbp的临床应用提供了依据。同时，丁苯酞在脑出血方面正在开展国家十三五项目“丁苯酞对急性脑出血的干预及保护研究”，标志着丁苯酞在临床方面对脑出血领域的探索。

04 背景资料

恩必普（化学名：丁苯酞）是石药新药研发成果的代表之一，是我国第三个具有自主知识产权的国家一类新药，也是脑卒中治疗领域的全球领先药物，上市以来为1000多万名卒中患者治愈或减轻了疾病困扰。




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